ルイジアナ州立大学ヘルス・シュリーブポート学部、生化学・分子生物学科、ルイジアナ州、アメリカ合衆国。
ERCC6、別名CSB (Cockayne Syndrome B)は、DNA修復プロセスであるtranscription-coupled nucleotide excision repair (TC-NER)に関与する重要なタンパク質です。ERCC6は、染色体構造変化、転写制御、酸化ストレス応答、および他のDNA修復タンパク質との協調など、多岐にわたる役割を果たします。ERCC6の変異は、Cockayne症候群やその他の神経変性疾患を引き起こしますが、一部の変異、例えばM1097Vは、特にルイジアナ州に居住するアフリカ系アメリカ人（AAs）における前立腺がん（PCa）のリスクと関連付けられています。最近の研究では、PCa、特にAAsにおけるERCC6変異の機能的な影響が調査されています。注目すべき発見として、M1097V変異は細胞の紫外線損傷に対する耐性を高めることが示されており、これは進化的な利点をもたらす可能性がある一方で、複雑な環境発がん物質に曝露された際の変異誘発のリスクも示唆しています。AA患者におけるPCaで観察されるミスマッチ修復（MMR）およびヌクレオチド切除修復（NER）遺伝子の高い変異負荷を考慮すると、TC-NERおよび相同組換え修復（HRR）経路を標的とする合成致死戦略が有効である可能性があります。具体的には、CDDP (シスプラチン)とRAD54阻害剤、例えばJ54を組み合わせることが考えられます。
Transcription-Coupled Nucleotide Excision Repair (TC-NER) は、細胞のDNAに対する「スペルチェック」システムの一つです。細胞が遺伝子を読み込んでいる際、DNAに損傷があると、その過程が滞ることがあります。TC-NERは、その損傷を緊急的に修復し、細胞が遺伝子の読み込みを継続できるようにする、いわば救助隊のようなものです。これは、都市のすべての道路を点検するのではなく、現在車両が走行中の特定の高速道路の穴を埋める道路工事のようなものです。
アフリカ系アメリカ人の前立腺がん患者におけるM1097Vの頻度
コーカサス人の前立腺がん患者におけるM1097Vの頻度
前立腺癌（Prostate Cancer, PCa）は、最も頻繁に診断される非皮膚悪性腫瘍であり、アメリカ合衆国における男性の癌関連死亡の第2位の原因です。アフリカ系アメリカ人（African American, AA）の男性は、ヨーロッパ系の人種に比べて、この疾患の負担が 不均衡に高く、より高い発症率、より早い発症、および治療に抵抗性のある疾患による死亡率の増加が見られます。社会経済的状況や医療へのアクセスにおける格差がこれらの違いに寄与している一方で、蓄積された証拠は、遺伝子および分子レベルの変化を含む生物学的要因が、AA患者に見られる攻撃的な表現型を引き起こす上で重要な役割を果たしている可能性を示唆しています。
なぜ前立腺がんの格差が重要なのか？ 前立腺がんは、白人男性と比較して、アフリカ系アメリカ人男性に著しく高い割合で発症します。これは、発症率だけでなく、がんの進行度や死亡率にも現れています。社会的および経済的な要因も影響しますが、本論文では、特定の遺伝的な原因、すなわち、DNA修復遺伝子の変異に着目しています。この変異は、アフリカ系アメリカ人患者において21倍も多く見られます。これらの生物学的な違いを理解することで、最も影響を受けている集団のために特別に設計された治療法を開発できる可能性があります。
DNA損傷応答および修復経路（DDRR）、総称して「repairome」と呼ばれるものは、ゲノムの安定性を維持し、悪性変態を防止するために不可欠です。前立腺がん（PCa）において、主要なDNA修復遺伝子、例えばBRCA1、BRCA2、ATM、およびMLH1における変化は、腫瘍の進行、予後の不良、およびPARP阻害剤や白金製剤を含む標的療法への感受性に関連しています。PARP阻害剤（PARPi）が、転移性去勢抵抗性前立腺がん（mCRPC）の治療において大きな成功を収めており、新しい治療オプションを確立しています。シスプラチンベースの療法は現在、PCaの主要な治療法ではありませんが、現在の傾向としては、より低用量でDNA修復阻害剤と組み合わせることで、非常に効果的である可能性があります。
あなたの細胞は、DNA修復メカニズムという、総称してrepairome（レパローム）と呼ばれる、完全なツールキットを持っています。これらには以下が含まれます：
これらのシステムが機能不全になると、がんのリスクが劇的に増加します。PARP阻害薬（オラパリブなど）は、これらの欠陥を利用し、がん細胞がDNAを修復できなくなり、死滅させるという概念で、これをsynthetic lethality（合成致死性）と呼びます。
この研究では、M1097Vというゲノム変異を、PCa（前立腺癌）の一般的な細胞株群にCRISPR/Cas9を用いて導入しました。この細胞株群には、AA（アフリカ系アメリカ人）患者由来のPCa2細胞が含まれています。次に、この変異タンパク質が、TC-NER（トランスクリプション複合体修復）を必要とする損傷の修復（UV耐性およびシスプラチン耐性）にどのような影響を与えるかを調べ、この変異タンパク質が環境要因とどのように相互作用するかを初期評価しました。ルイジアナ州では、PCaの罹患率が非常に高く、遺伝的要因と食習慣の両方が、より高い罹患率と全体的な生存率の低下に寄与しており、さらに、地域特有の有害な環境要因も大きな健康リスクとなっています。
CRISPR/Cas9 ノックインは、特定の遺伝子を改変する技術であり、Cas9酵素がガイドRNAの指示に従ってDNAの特定の場所を切断し、細胞自身の修復機構が提供されたドナーDNAテンプレートを利用して、目的の変異を導入します。これは、DNAコードの特定の文字を「検索して置換」するようなものです。
ガイドRNA、ドナーDNA、およびTrueCut Cas9タンパク質は、ThermoFisher TrueDesignを使用して設計されました。細胞は、Opti-MEM中のCRISPRMAX試薬を用いて、70%のコンフルエンスでトランスフェクションされました。48時間後、単一細胞クローンを作成し、スクリーニングを行いました。
M1097V変異は、QuickChangeII SDMキットを用いて、OriGeneのベクターRC219020に導入されました。一時的な導入は、Lipofectamine-3000を用いて48時間行われました。
80Vの電圧で、EtBrを添加した1%アガロースゲル電気泳動を実施しました。クローンの確認のために、Hin1II (NlaIII) を用いたPCR-RFLPを行い、BIORAD ChemiDocシステムでイメージングした後、確認のためのシーケンス解析を行いました。
50,000個の細胞を播種し、30秒間UV照射を行った後、異なる時点での回収を行った。細胞溶解後、ドットブロットを行い、抗-CPD抗体を用いてシクロブタンピリミジン二量体を検出した。
96ウェルプレートに細胞を播種し、50%のコンフルエンスに達させた後、様々なUV照射量に曝露しました。細胞の増殖は、IncuCyte S3を用いて、位相差画像を取得しながら4時間ごとにモニタリングしました。
ADP-Hunterを用いて実験を行い、免疫精製されたERCC6を約50 ng、プラスミドDNAを±50 ng使用しました。反応速度は、37℃で15分間の予備インキュベーション後、定常状態での測定によって評価しました。
GraphPad Prism 9 を使用して統計分析を行います。結果は平均値 ± 標準誤差 (SEM) で示します。2群間の比較には Student の t 検定を用います。有意水準: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.
ERCC6は、酵母から哺乳類まで、非常に保存されている必須遺伝子です。その必須性から、変異は稀であり、PCa TCGA-500データベースからはほとんど検出されません。したがって、M1097V変異の異常な頻度、特にアフリカ系アメリカ人において、はルイジアナ州の集団特有の現象である可能性があります。ゲノムにおける部位特異的変異導入実験から、M1097V変異は、CRISPRを介した組換えによって複数の細胞株に導入され、ヘテロ接合体およびホモ接合体（二重アレル）の変異体が得られました。
M1097V変異を持つ細胞株が利用できないため、CRISPR技術を用いた遺伝子編集により、この変異を導入しました。M1097Vの導入は、複数の前立腺癌細胞株において行われ、検証されました。これらの細胞株には、C4-2B, DU145, PC3, および PCa2 (アフリカ系アメリカ人由来の細胞株)が含まれます。ヘテロ接合体およびホモ接合体（二重アレル）の両方のクローンが得られ、PCR-RFLPおよびシーケンシングによって確認されました。
| Component | Sequence / Value |
|---|---|
| Guide RNA | GTTACATTACTACTCATGTG |
| Donor DNA | CTAATCGAAGTGATCCTTTGAAAGATGA CCCTCACGTGAGTAGTAATGTAACTAGCA ATGATAGGCTTGGAGA |
| ERCC6_SEQ_FWD_P1 | GTTCAGACACCCAAATGCCA |
| ERCC6_SEQ_FWD_P2 | AAACGCAAGAAGTTCCCTGC |
| ERCC6_SEQ_REV_P1 | AGGGTCTCTTCTTCTGCCAC |
| ERCC6_SEQ_REV_P2 | CTTCTGTTTGAGCCTGGCTG |
| Target Sequence | GTTACATTACTACTCATGTG |
| PAM | AGG |
| Score | 97.09 |
| Genomic Location | chr10[49470654] |
当初の仮説とは異なり、M1097V変異は、UV線照射に対する耐性を高め、UV線によって誘発されたCPD（シクロピリミジン二量体）の修復をより速くすることが示されました。特定の条件下では、「過剰に活性化された」TC-NER（トランスレション修復）機構は、不活性または機能不全の機構よりも変異原性を持つ可能性があります。実際、より速い修復は、相補鎖の置換中にミスマッチを導入する可能性を paradoxically（逆説的に）高めることがあります。
これは、本研究で最も驚くべき、そして直感に反する発見です。DNA修復タンパク質に突然変異があると、修復が悪化すると予想されるかもしれません。その結果、細胞はDNA損傷に対してより脆弱になる可能性があります。しかし、M1097V変異体は、実際には修復を速くするのです。
なぜ、より速い修復が悪いことになるのでしょうか？道路を修理する作業員が、急いで作業していると想像してみてください。もし彼らが速すぎると、間違った材料を使用したり、不完全な仕上がりになったりするかもしれません。同様に、TC-NERが速すぎると、修復された隙間を埋めるDNAポリメラーゼが、間違った塩基を挿入する可能性が高くなります。特に、近くに酸化損傷（例えば、8-オキソグアニン）がある場合です。これらのミスマッチは、がんの進行を引き起こす突然変異につながる可能性があります。
そのため、著者はこれを、「過剰に活性化された」TC-NER機構と呼び、これは不全なものよりも変異原性が高いと述べています。
ERCC6変異体クローンにおいて、UVおよびCDDPに対する感受性を評価しました。驚くことに、M1097V変異は、UV照射量に対するある程度の耐性を付与し、UV誘発性シクロブタンピリミジン二量体（CPDs）の解消を加速させました。興味深いことに、AA患者由来のPCa2株も、他のすべての株と比較して、CPDsの除去において顕著な活性を示しました。このUV耐性は、ERCC6に依存していることが明らかであり、なぜならsiRNAによるノックダウンが、UVに対する生存率を大幅に低下させるからです。コントロール細胞であるNT1-Nek1-KO細胞は、1日後であっても、ほとんどDNA修復（CPDsの除去）を示しませんでした。
NER（ヌクレオチド除去修復）による切創部位でのDNA鎖置換において、特に嵩高い損傷が存在し、さらに8-オキソグアニン（8OG）が存在する場合、ミスマッチが導入される可能性が非常に高いです。ミスマッチ修復（MMR）は、正確なDNA鎖の識別が不足しているため、実際には、嵩高い損傷に対するNERによる修復よりも変異原性が高い場合があります。したがって、UV感受性（CPD除去によって制御される）とCDDP感受性（複雑な経路を介して制御される）は、一般的に予想されるように必ずしも一致するわけではありません。
紫外線に対する耐性という特性とは異なり、シスプラチン (CDDP) に対する反応は異なるパターンを示しました。紫外線感受性（CPDの除去を介して発現）とシスプラチン感受性（NERやHRRを含む複雑な経路を介して発現）は、重複するメカニズムではありません。 CSBは、紫外線による損傷の修復には有効かもしれませんが、シスプラチンによって引き起こされる損傷には必ずしも有効ではありません。重要な点として、これは、AA-PCaで見られるERCC6の変異は、依然としてNERとHRRの組み合わせ戦略によって標的とすることができるということです。なぜなら、これらの戦略は、シスプラチンによるインター/イントラストランド架橋（CDDP-ISLs）の処理中に、より多くの二重鎖切断（DSBs）をもたらすことが予想されるからです。
紫外線による損傷 ≠ シスプラチンによる損傷： 両者ともDNAの損傷を伴いますが、修復のメカニズムは大きく異なります。紫外線はシクロブタンピリミジン二量体（CPDs）を生成し、これはDNAの局所的なねじれを引き起こします。一方、シスプラチンは、DNAの異なる部分を繋ぐインターストランド架橋（ISLs）およびイントラストランド架橋（ISLs）を生成し、これらを修復するには、NER と相同組換え修復（HRR）の両方が必要です。そのため、M1097Vは、細胞が紫外線による損傷への耐性を高める一方で、シスプラチンベースの療法によって標的となり得る状態を維持することができます。
精製されたERCC6野生型とM1097V変異体のATPアーゼ活性を、ADP-Hunterアッセイを用いて比較しました。M1097V変異体は、DNA依存性のATPアーゼ速度においてわずかな違いを示しました。これらの複雑なATPアーゼサイクル（その一部はDNA非依存性）は、大きな構造変化を促進するとともに、停止した転写伸長複合体を排除します。詳細な生化学的研究、E. coli のERCC6相同タンパク質であるMfdで行われた研究と同様のものが、この変異が酵素機能に与える影響を完全に解明するために必要です。
ATPase活性 は、タンパク質がATP（細胞のエネルギー源）をどれだけ効率的に利用して機械的な仕事を行っているかを示す指標です。ERCC6/CSBは、ATPのエネルギーを利用して、RNAポリメラーゼを損傷したDNAから物理的に押し出す分子モーターです。ADP-Hunterアッセイは、このプロセスを、時間経過とともに消費されるATPの量を追跡することで測定します。
コックサイン症候群 (Cockayne Syndrome) は、ERCC6遺伝子の変異によって引き起こされるまれな遺伝性疾患であり、この変異はタンパク質を完全に阻害します。患者は、早老化、神経変性、成長障害などを経験します。本研究で検討されたM1097V変異は、それほど重篤ではありません。これは、タンパク質の機能を完全に排除するのではなく、わずかな変化をもたらすものであり、その結果、影響がより微妙です。
機能喪失変異は重篤な症候群を引き起こす一方で、ほとんどのミスセンス変異の機能は十分に研究されていません。M1097V多型は、世界中のいくつかの癌種におけるメタ解析で、有意な癌リスク因子として特定されており、最近、AA-PCa（アフリカ系アメリカ人の前立腺癌）において、白人に比べて異常に高い頻度（21% vs 1%）で認められています。M1097V変異体におけるより迅速なCPD（シトシン-ピリミジン二重鎖の損傷）修復活性は、当初の仮説を再考させることになりました。つまり、"過剰に活動"するTC-NER（トランスレセプタ・修復）機構は、特定の条件下では、急速な鎖置換中に生じるミスマッチの増加により、逆説的により変異原性を持つ可能性があります。
AA-PCaで見られるERCC6の変異は、依然としてNERとHRRの組み合わせ戦略によって効果的に標的とすることができます。例えば、シスプラチン（CDDP）とJ54（RAD54阻害剤）という合成的に致死的な組み合わせが挙げられます。これらの組み合わせは、シスプラチンの架橋処理中に、より多くの二重鎖切断を引き起こすことが期待され、TC-NER活性が亢進した細胞に対しても、有効な治療アプローチとなり得ます。
合成致死性とは、燃えている建物の両方の出口を塞ぐようなものです。特定のDNA修復機能の欠陥を持つ癌細胞は、バックアップの修復経路に依存しているため、生き残ることができます。しかし、バックアップ経路も阻害すると、細胞はDNAの損傷を修復する方法がなくなり、死んでしまいます。
このアプローチは、特にERCC6の変異を持つ腫瘍を持つアフリカ系アメリカ人の前立腺癌患者にとって、画期的な治療法となる可能性があります。これは、アンドロゲン除去療法（ADT）という、QOL（生活の質）に大きな影響を与える副作用を持つ治療法に対する代替手段となる可能性があります。
AA（アフリカ系アメリカ人）は、前立腺がん（PCa）を発症するリスクが高く、より進行性の、治療に反応しにくい疾患を発症する傾向があります。多くのPCa治療法がアンドロゲン受容体（AR）シグナル阻害に焦点を当てているため、DNA修復を標的とする併用療法は、アンドロゲン除去療法（ADT）の必要性を回避または排除し、その重大な副作用を軽減する可能性があります。これは、特に神経内分泌性前立腺がん（NEPC）の場合に重要であり、AA患者に多く、ADT/ARSI（アンドロゲン受容体シグナル阻害薬）に反応しない傾向があります。
内因性のERCC6の発現は非常に低い水準であり、さらにERCC6-PGBD3というトランスポゾン融合遺伝子によって複雑化されています。今後の研究では、S636N変異（ルイジアナ州の前立腺がん（PCa）にのみ見られる）、より詳細なATPアーゼの解析、およびERCC6が介在する転写複合体の置換という複雑な生化学的サイクルに関する調査が含まれます。
この研究は、DNA修復および転写制御において、特にTC-NER経路を通じて、ERCC6/CSBが果たす極めて重要かつ多面的な役割を強調しています。M1097V変異は、前立腺がん細胞における紫外線耐性を高めることが示されており、これは、現代の治療に示唆を与える可能性のある進化的な適応を示唆しています。この変異、および他のERCC6の変異は、主に前立腺がんを持つアフリカ系アメリカ人（AA）患者に見られることが多く、これらが治療反応の違いを説明する可能性があります。NERおよびHRR経路の両方を標的とする合成致死アプローチ（例：CDDP + J54）は、アンドロゲン除去療法に対する個別化された代替手段となり得る可能性があり、前立腺がんの格差を是正するための有望な方向性を示唆しています。
OO: 概念化、データキュレーション、形式分析、調査、方法論、検証、論文のレビュー・編集、原稿執筆。 AD: 概念化、形式分析、資金調達、調査、プロジェクト管理、指導、検証、原稿執筆、論文のレビュー・編集。
Chancellor Award 2024をABに授与。
著者らは、LSU Health ShreveportのINLET施設（RRID: SCR_024775）に感謝します。特に、IncuCyteの使用に関する支援をいただいたAna Maria Dragoi氏とBrian Latimer氏に深く感謝いたします。
著手者は、本研究が、潜在的な利益相反につながる可能性のある、いかなる商業的または金銭的な関係なしに実施されたものであることを表明しました。
この論文の結論を裏付けるデータは、著者が特別な制限なしに公開します。